Od pojedynczych komórek do złożonych układów - zmiany molekularne wykrywane za pomocą technik spektrometrii mas

**Rodzaj grantu:** IDUB - „Excellence initiative – research university” for the AGH University of Krakow.\\ **Kierownik projektu:** [[katedra_biochemii_i_neurobiologii:pracownicy:kulakowska|Anna Bodzoń-Kułakowska]]\\ **Czas realizacji:** 2023 – 2025.\\
**Publikacje:** **Wniosek grantowy** Techniki spektrometrii mas zrewolucjonizowały badania biochemiczne. Pozwalają one na analizę makromolekuł w materiale biologicznym i badanie zmian jakim podlegają pod wpływem różnych procesów. W laboratorium Zespołu Biochemii i Neurobiologii pracuje grupa o bardzo dużym doświadczeniu w badaniach proteomicznych i obrazowaniu powierzchni za pomocą spektrometrii mas (MSI- ang. mass spectrometry imaging). Proteomika to technika, pozwalająca na analizę białek. Wynikiem badań proteomicznych jest wskazanie zmian zarówno jakościowych jak i ilościowych w białkach badanego modelu pod wpływem różnych czynników. Efektem może być rozpoznanie możliwości wpływu na określony proces w organizmie (np zastosowanie inhibitora, jeśli podłożem wykrytej zmiany jest dysfunkcyjny enzym). Z kolei techniki MSI pozwalają na uzyskanie widm masowych charakterystycznych dla punktów na badanej powierzchni. Intensywność uzyskanych pików pozwala ocenić w przybliżeniu ilość danej substancji w określonym miejscu. Połączenie informacji z widm masowych, z ich lokalizacją na powierzchni pozwala na zobrazowanie rozmieszczenia substancji w materiale podlegającym analizie. W rutynowo stosowanej przez nas technice MALDI możliwe jest badanie zmian w rozmieszczeniu i ilości określonych lipidów, oraz białek w próbkach biologicznych. Ma to znaczenie zwłaszcza w analizach tkanek mózgu, który jest złożony z różnych struktur. Ich odrębność jest kluczowa i możliwa do zachowania i wizualizacji przy analizach MSI. W oparciu o te strategie chcemy opracować dwa intrygujące zagadnienia: zmiany molekularne w tkankach centralnego układu nerwowego pod wpływem podawania morfiny i zmiany molekularne w oocytach ssaczych. Pozorna rozbieżność tematyki wynika z zastosowania doskonalonego przez lata warsztatu badawczego do rozstrzygnięcia serii zagadnień w ramach współpracy z bardzo dobrymi zespołami badawczymi z wykorzystaniem dostępnych nam technik analitycznych. Uzależnienie od narkotyków jest problemem medycznym, społecznym i ekonomicznym. Rozwikłanie jego molekularnych podstaw pozwoli na znalezienie skutecznych metod farmakologicznego leczenia, a metody analizy stosowane w naszym zespole uwzględniają złożoność przestrzenną centralnego układu nerwowego. Oocyty to szczególny rodzaj materiału, gdzie ważna jest indywidualna zmienność pojedynczej komórki. Może ona wpływać na jej potencjał rozwojowy w procedurze in vitro. Wiele procesów związanych z metabolizmem oocytów nadal pozostaje niewyjaśnionych. Poznanie ich będzie miało ogromne znaczenie m.in. dla ratowania wymierających gatunków, dla których jedyną praktycznie istniejącą możliwością uzyskania potomstwa są procedury in vitro. W naszym laboratorium opracowaliśmy unikalną metodologię pozwalającą na analizę oocytów z wykorzystaniem MSI i technik proteomicznych. Pozwala to na szczegółowe analizy molekularnych podstaw procesu zapłodnienia na modelu ssaczym w postaci reprezentatywnego i bazującego na dostępnym materiale weterynaryjnym modelu oocytów kocich. Proponowane przez nas badania opierają się o zastosowanie innowacyjnych technik analitycznych związanych ze spektrometrią mas (analizy proteomiczne w oparciu o ilościowe techniki znakowania izotopowego TMT, obrazowanie powierzchni za pomocą spektrometrii mas) a także dotyczą palących problemów, zarówno medyczno-socjologicznych (uzależnienie od narkotyków), jak i związanych z ochroną i ratowaniem środowiska naturalnego. Uzależnienie to problem, którego społeczeństwo stara się nie zauważać lub ignorować. Niestety zmiany społeczne, niedawna pandemia COVID-19, coraz wyższe tempo życia i presja społeczna sprawiają, że coraz więcej osób coraz częściej sięga po substancje pozwalające zapomnieć na chwilę o otaczających nas problemach. Problem uzależnienia od opioidów pojawił się nawet w kampanii prezydenckiej Hilary Clinton w Stanach Zjednoczonych, gdzie przez kryzys opioidowy w 2008 liczba zgonów na skutek przedawkowania przewyższyła liczbę śmiertelnych ofiar wypadków samochodowych, a przedawkowanie stało się głównym powodem śmierci z przyczyn innych niż naturalne. Zrozumienie molekularnych zmian jakie zachodzą w mózgu na skutek działania narkotyków i uzyskanie możliwości ingerencji w proces uzależnienia być może pozwoli na znalezienie skuteczniejszego sposobu leczenia tego zespołu chorobowego. W naszych badaniach do tego celu wykorzystujemy morfinę jako reprezentanta substancji odurzających, charakteryzującego się dobrze poznanym i szeroko funkcjonującym w literaturze modelem zwierzęcym. Jeżeli chodzi o badawcze trendy to ilość publikacji dotyczących uzależnienia od opioidów od 2017 roku wykazuje trend wzrostowy (od 750 w 2017 do 1276 w 2022). Ilość cytatów liczona za pomocą Field-Weighted Citation Impact spada, natomiast w 2022 osiągnęła wynik 1.11 co i tak świadczy o 10% lepszym wyniku cytowalności niż przewidywany dla przeciętnego artykułu. Procedury in vitro najczęściej odnosimy do ludzkich problemów z płodnością i kojarzą nam się one jednoznacznie z zabiegami medycznymi. Okazuje się, że mają one również ogromne znaczenie w przypadku ratowania zagrożonych gatunków zwierząt. W 2001 pozostały na świecie 32 sztuki nosorożca białego. Próby naturalnego pozyskania potomstwa tych zwierząt nie powiodły się. W 2018 roku zmarł ostatni samiec tego gatunku. Na szczęście, dzięki projektowi BioRescue posiadamy pobrane wcześniej nasienie nosorożca białego. Od ostatnich dwóch żyjących samic pobrano komórki jajowe. Obecnie jedyną szansą na uratowanie gatunku są procedury medyczne z grupy technik IVF (ang. in vitro fertilization) lub ICSI (ang. intra- cytoplasmic sperm iniection). Podobna tragedia rozgrywa się w przypadku dzikich kotów. Sztuczne zapłodnienie może być dobrym sposobem na zwiększenie ich populacji. W 2019, po 15 latach badań i dwóch nieudanych próbach, dzięki procedurze IVF udało się doprowadzić do narodzin dwóch gepardów w Ogrodzie Zoologicznym National Columbia. W Polsce, między innymi dzięki współpracy Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu z Uniwersytetem Rolniczym w Krakowie, powstaje bank materiału rozrodczego europejskich dzikich kotów, w tym rysia i żbika. Wydawałoby się, że o procedurach IVF wiemy wszystko – przecież z powodzeniem stosujemy je u ludzi. Ale Homo Sapiens to nie Felis Silvestris, ani Lynx a biolodzy badający problem zapłodnienia zewnątrzustrojowego znajdują coraz więcej subtelnych różnic pomiędzy możliwościami wspomagania rozrodu człowieka i wspomagania rozrodu innych gatunków. Zwierzęta wymagają innego, charakterystycznego dla każdego gatunku podejścia. Nasze badania, w ścisłej współpracy z Uniwersytetem Rolniczym w Krakowie, mają na celu zbadanie różnic molekularnych (badanie lipidów i białek) między oocytami kota domowego o różnym potencjale stworzenia zarodków w procedurze in vitro. Kot domowy, zgodnie z dostępną literaturą, jest doskonałym modelem badawczym dla wspomagania rozrodu wymierających dzikich kotów. Mamy nadzieję, że prowadzone prace pozwolą na stworzenie lepszych procedur IVF i przynajmniej w części przyczynią się do uratowania ginących gatunków chroniąc je przed całkowitym unicestwieniem. Badania z tej dziedziny, czyli badania molekularne, w kontekście ratowania zagrożonych gatunków wydają się być wysoce unikalnymi i trudno dla nich znaleźć kategorię w bazie SciVal. Kategoria „Veterinary Medicine; in Vitro Techniques” istnieje, ale nie jest wspominana w kontekście ratowania zagrożonych gatunków.